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ELISA實驗包驗被抗原與包被細胞步驟
  • 發布日期:2024-10-14      瀏覽次數:404
    •   酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,簡寫ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。
       
        一、包被抗原
       
        1.   用 50mM  的碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)溶解抗原,使抗原濃度為 10-20 μg/ ml, 加 100 μl/孔到 96 孔酶標板, 4 oC 放置過夜。
       
        2.   第二天棄去包被液后, 用 PBST 洗滌 3 次,每孔加入 150 μl  1% BSA 37 oC封閉 1 小時。
       
        3.   PBST 洗滌 3 次后,每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清,并加入對照樣品, 37 oC 孵育 2 小時。
       
        4.   PBST 洗滌 5 次后,加入 100μl 稀釋后的 HRP 標記的二抗,37 oC 孵育 1 小時。
       
        5.   PBST 洗滌 5 次后,顯色劑顯色 20min 后,酶標儀上讀取 A405 吸收值。
       
        二、包被細胞
       
        1.   在 96 孔培養板上接種細胞數為 1 x 104  cells/well ,37℃過夜培養。
       
        2.   第二天用 PBS 洗滌培養板 2-3 次。
       
        3.   加入 125 µl/well 10% Formalin(1:10 稀釋) , 室溫下固定 15 min。
       
        4.   用 ddH2O 洗滌培養板 3 次,并晾干,儲藏在 2-8oC 備用。
       
        5.   用 PBST 洗滌 3 次,每孔加入 150 μl 1% BSA 37 oC 封閉 1 小時。
       
        6.   PBST 洗滌 3 次后,每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清,并加入對照樣品, 37 oC 孵育 2 小時。
       
        7.   PBST 洗滌 5 次后, 加入 100 μl 稀釋后的 HRP 標記的二抗,37 oC 孵育 1 小時。
       
        8.   PBST 洗滌 5 次后,顯色劑顯色 20min 后,酶標儀上讀取 A405 吸收值。
       
        50mM 的碳酸鹽包被緩沖液: 0.05mol/L pH9.6 碳酸緩沖液,4℃,保存, Na2CO3 0.15 克, NaHCO3  0.293 克,蒸餾水稀釋至 100 ml。
       
        ABTS 作為底物進行顯色反應(10ml):
       
        1)、0.2M Na2HPO4 2.4ml
       
        2)、0.1M    檸檬酸 2.6ml
       
        3)、ddH2O  5ml
       
        4)、ABTS 5mg
       
        5)、H2O2(30%)    4 ul(用前加入)
       
        注 意:
       
        1、一般做倍比稀釋進行檢測,需要有相應的對照血清。
       
        2、不同的顯色系統對應不同的光吸收值。
       
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