1、溫育的溫度：
育常采用的溫度有43 、37℃、室溫或4℃等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數抗原抗體結合的最適反應溫度。抗原抗體反應一般在37℃經1～2 h 產物的生成可達ding峰，為加速反應，可在一定范圍內提高反應的溫度并在反應過程中連續振蕩來增加抗原抗體接觸的概率。抗原抗體反應在4℃更為徹di，形成的產物更多、更穩定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。
2、溫育的方式：
溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結果的吸光度差異（即“邊緣效應"）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應板不能重疊放置，防止溫度擴散的不均勻性。
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